Вкусовые характеристики и химический состав чая Улун.

Введение

    Tieguanyin, превосходный сорт чая Улун, приготовленный методом легкой ферментации (20–50%), очень популярен в Китае. Существует три вида Tieguanyin с различными ароматами (Zhengzuo, Xiaoqing и Tuosuan), которые производятся путем варьирования времени полуферментации.

Аромат чая Улун связан с сочетанием различных соединений, таких как катехины (горечь), аминокислоты (свежесть), растворимый сахар (soluble sugar) (сладость), теафлавины (бодрость) и теарубигин (мягкость). Было обнаружено, что ряд гликозидов флавонола вносит основной вклад в вяжущий вкус настоя черного чая.

Многие из основных вкусовых соединений в чае Улун, такие как 2 алкалоида, 11 флаван-3-олов, 8 органических кислот и сложных эфиров и 3 теафлавина, были идентифицированы с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в сочетании с УФ-спектрофотометрией и масс - спектрометрией.

Было обнаружено, что полуферментация значительно влияет на вкус чая Улун. Полуферментация во время обработки чая Улун включает естественные реакции потемнения, вызванные окислительными ферментами в клетках чайных листьев. Однако вкусовые характеристики чая Tieguanyin oolong еще не полностью поняты.

Это исследование было направлено на изучение вкусовых характеристик чая Tieguanyin oolong из свежих чайных листьев, обработанных в течение различного времени полуферментации. Мы проанализировали связь между вкусом и химическими компонентами. Наши результаты могут предоставить полезную информацию для модификации процесса ферментации для различных вкусов чая Tieguanyin oolong путем изменения его вкусовых характеристик и концентрации его химических компонентов.

Материалы и методы. Эталонные материалы.
 

Стандартные катехины: галлокатехин (GC), эпигаллокатехин (EGC), эпигаллокатехин галлат (EGCG), эпикатехин (EC), галлокатехин галлат (GCG), эпикатехин галлат (ECG)), теафлавины (теафлавин (TF), теафлавин-3-галлат (TF3G), теафлавин-3'-галлат (TF3'G) и теафлавин-3,3'-дигаллат (TFDG); флавонолгликозиды: витексин (Vit), кверцетин (Que), мирицетин (Myr), кемпферол (Kae), мирицетин-рамноза (Myr-rha), мирицетин-галактоза (Myr-gala), кверцетин-галактоза (Que-gala), кверцетин-глюкоза (Que-glu), витексин-рамноза (Vit-rha), кемпферол-галактоза (Kae-gala), кемпферол-рамноза (Kae-rha) и кемпферол-глюкоза (Kae-glu); аминокислоты: фосфосерин, аспарагиновая кислота, треонин, серин, глутаминовая кислота, теанин, аланин, цистеин, тирозин, фенилаланин, β-аланин, γ-аминомасляная кислота, гистидин, триптофан, лизин и аргинин; кофеин, глутамат натрия, глюкоза и летучие вещества (линалоол, цис-3-гексенилгексаноат, этилкапрат и н-парафины C6 -C20) были куплены у Sigma (Шанхай, Китай).

Кверцетин-рутинозид (Que-rut) и кверцетин-рамноза (Que-rha) были приобретены у Mansite Bio-Technology Co., Ltd. (Чэнду, Китай).

Побеги чайного растения [Camellia sinensis (L.) O. Kuntze cv. Tieguanyin] с четырьмя листьями и почкой были собраны в апреле 2013 года в округе Анси провинции Фуцзянь.

После того как чайные листья завяливали при 35°С в течение 40 мин, их распределяли в кондиционированной комнате (20°С) для сушки в течение 1 часа. Затем мы встряхивали и катали листья три раза (5 минут в первый раз, 15 минут во второй раз и 40 минут в третий раз), оставляя их на 2 часа между циклами, чтобы дать им возможность частично ферментироваться.

Впоследствии их подвергали приготовлению в течение различного времени (12, 16, 20, 24, 28 и 32 ч) в кондиционированном помещении (20°C, относительная влажность 70%).

После этого ферментированные листья подвергали прожариванию при 170°C в течение 12 минут, сминали и скручивали пять раз, а затем обжаривали при 110°C в течение 30 минут до конечного содержания влаги 4%.

Сухие листья в конечном итоге хранили в морозильной камере при -20°C для дальнейшего использования.

Приготовление чайного настоя

Три грамма образца чая Tieguanyin oolong настаивали в 150 мл чистой свежекипяченой воды в течение 6 минут, в соответствии с китайскими национальными стандартами сенсорной оценки чая. Настои были немедленно использованы для сенсорной оценки и анализа химического состава.

Сенсорная оценка

В описательном анализе использовались эталонные материалы, содержащие мономеры галлат эпигаллокатехина, кофеин, глутамат натрия, глюкозу, линалоол и цис-3-гексенилгексаноат.

Перед оценкой настоя чая Улун, участники исследования прошли отбор и обучение для изучения и определения вкуса стандартных образцов в различных концентрациях.

Для оценки была использована 10-балльная шкала, основанная на методе, описанном Alasalvar. Оценка, основанная на 10-сантиметровой линейной шкале, где 0 - самая слабая, а 10 - самая сильная, была проведена десятью хорошо подготовленными участниками исследования. Каждая оценка была случайным образом повторена три раза в разные дни.

Анализ химического состава

Условия ВЭЖХ были следующими: объем инъекции 10 мкл, 5 мкм Diamonsil™C18 (4,6мм×250мм) колонка, температура 35°C, раствор ацетонитрил/уксусная кислота/вода (6:1:193) в качестве подвижной фазы A, раствор ацетонитрил/уксусная кислота/вода (60:1:139) в качестве подвижной фазы B, линейный градиент от 100% подвижной фазы A до 100% подвижной фазы в течение первых 45 мин, а затем 100% подвижной фазы B до 60 мин, скорость потока 1 мл / мин и набор ультрафиолетового детектора Waters 2487 [Waters (Shanghai) Corporation] при 280 нм.

Флавонольные гликозиды и флавонолы

Условия ВЭЖХ были следующими: объем впрыска 10 мкл, 5 мкм Diamonsil™C18 (4,6мм×250мм) колонка, температура 25°C, раствор ацетонитрил/муравьиная кислота/вода (20:1:646) в качестве подвижной фазы A и раствор ацетонитрила/муравьиной кислоты /воды (200:1:466) в качестве подвижной фазы B. Градиентное элюирование начинали при 100% подвижной фазы A и 0% подвижной фазы B, в которой концентрация подвижной фазы A поддерживается в течение 23 мин. После этого концентрацию подвижной фазы В линейно увеличивали до 50% в течение 7 минут, до 62,5% в течение 10 минут, до 80% в течение 5 минут и до 100% в течение 3 минут. Наконец, концентрацию подвижной фазы B поддерживали на уровне 100% в течение 35 минут. Скорость потока составляла 1 мл/мин, и детектор представлял собой ультрафиолетовый детектор Waters 2487 [Waters (Shanghai) Corporation], настроенный на 360 нм.

Свободные аминокислоты

Пять миллилитров чайного настоя выпаривали, и высушенный образец растворяли в 0,02 N раствора HCl. Свободные аминокислотные компоненты определяли с помощью аминокислотного анализатора (Hitachi 835-50, Tokyo, Japan). Соответствующими условиями были одна колонка из нержавеющей стали с микропробой (внутренний диаметр 2,6 мм, длина 15 см), максимум пять программируемых буферов для элюирования и один регенерант. Материал колонки представлял собой обычную катионообменную смолу Hitachi № 2619F. Скорость потока буферов и нингидрина составляла 0,25 и 0,30 мл/мин соответственно. Аминокислоты, отделенные катионообменной хроматографией, детектировали спектрофотометрически после постколоночной реакции с нингидриновым реагентом. Содержание свободных аминокислот в каждом образце рассчитывали методом нормализации площади.

Летучие соединения

Использовали устройство для твердофазной микроэкстракции (SPME) (Supelco, Bellefonte, PA, USA), состоящее из волокон плавленого кварца, покрытого 50/30 мкм дивинилбензол/карбоксен /полидиметилсилоксаном. Волокно предварительно кондиционировали в течение 10 минут в отверстии для впрыска газового хроматографа при 260°С для удаления любых летучих веществ, оставшихся на волокне, перед каждой экстракцией. Три грамма образца сухого чая переносили во флакон на 500 мл и настаивали в 150 мл кипящей воды, а затем добавляли 20 мкл раствора этилкапрата. Флакон выдерживали в водяной бане при 50°C для уравновешивания в течение 5 минут, а затем волокно SPME экспонировали в течение 30 минут с свободным пространством, пока образец поддерживали при 50°C. После отбора пробы жидкости SPME волокно SPME вводили в инжектор газового хроматографа в режиме без разделения и выдерживали там в течение 3 минут, чтобы дать возможность термической десорбции аналита.

Для проведения анализа использовали газовый хроматограф Agilent (Лас-Вегас) 6890, сопряженный с масс-спектрометром Agilent HP 5973 MSD с ионной ловушкой. Капиллярная колонка DB-5MS (60×0,25×0,32 мкм) использовалась отдельно. Температура в печи для газового хроматографа была запрограммирована следующим образом: выдерживание при 50°С в течение 5 мин, повышение до 180°С со скоростью 3°С/мин, выдерживание при 180°С в течение 2 мин, повышение до 250°С со скоростью 10°С/мин и, наконец, выдерживают при 250°С в течение 3 мин. Газ-носитель, гелий (>99,999%-ной чистоты), использовали при постоянной скорости потока 1 мл/мин. Масс-спектрометр работал в режиме EI при энергии электронов 70 эВ. Температура инжектора и источника ионов составляли 250 и 230°С соответственно, а диапазон сканирования для МС составлял 35–400 АМЕ. Идентификация летучих соединений была основана на библиотеке Национального института стандартов и технологий (98L). Линейные индексы удерживания (RI), рассчитанные с использованием н-парафинов C6-C20 в качестве внешних ссылок, были сопоставлены с ранее опубликованными индексами Kovat. Концентрации компонентов, рассчитанные на основе раствора IS, были в мкг/л, и эксперименты для каждого образца чая были в трех экземплярах.

Все зарегистрированные результаты, полученные в результате трех повторов, были представлены как средние значения. Значительные различия между средними значениями анализировали односторонним ANOVA с использованием SPSS (версия 16, SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс, США). Корреляция между данными (в терминах r) была оценена с использованием корреляционного анализа Пирсона.

На вкусовые и ароматические свойства настоя чая Tieguanyin oolong влияло время полуферментации (таблица 1).

С увеличением времени полуферментации степень полуферментации возрастала, а

• интенсивность сладкого послевкусия и вкуса зеленых фруктов увеличивалась;
• интенсивность цветочного аромата увеличивалась, а затем уменьшалась;
• интенсивность вяжущего, горького и умами-вкуса не показала существенных изменений.

 Вышеуказанные изменения могут быть связаны с изменением вкусовых соединений во время инфузии. Также сообщалось, что степень полуферментации влияет на качество аромата чая Tieguanyin oolong через изменения в химическом составе. Поэтому интересно, как время полуферментации влияет на вкус чая улун.

Влияние  времени полуферментации на концентрацию вкусо-активных соединений в настое чая Tieguanyin oolong

Смесь шести катехинов (GC, EGC, EGCG, EC, GCG и ECG) и четырех теафлавинов (TF, TF3'G, TF3″G и TFDG) были идентифицированы с помощью ВЭЖХ (таблица 2). Общая концентрация катехина варьировала от 380,85 до 389,81 мг/л. Мы определили EGCG (126,65–146,60 мг/л), EGC (74,44–89,66 мг/л), EC (66,43–74,19 мг/л) и ЭКГ (37,73–43,32 мг/л) в качестве основных катехинов, со всеми четыре составляли 87,2% от общего количества катехинов в среднем (таблица 2).
Оригинал статьи, таблицы и ссылки на литературу: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5821678/

С увеличением времени полуферментации общая концентрация катехина снижалась. В частности, концентрация галлатированных катехинов значительно снизилась, поскольку они гидролизуются в простые катехины и галловую кислоту. Кроме того, концентрация галловой кислоты заметно увеличилась во время обработки чая Улун из-за разложения EGCG. Общая концентрация теафлавина в чаях Улун составляла от 14,19 до 16,97 мг/л. TF был наиболее распространенным соединением, составляя 77,8–85,8% от общего количества теафлавинов.

Эти результаты показывают, что полуферментация чая Улун влияет на синтез теафлавина. Общие концентрации катехина снижались во время ферментации, в то время как общие концентрации теафлавина имели тенденцию к увеличению. Катехины могут быть окислены оксидазой в теафлавины и теарубигины.
   Катехины и продукты их окисления в основном объясняют вкус и вяжущий характер чая Улун. Было обнаружено, что катехины вносят значительный вклад в вяжущий и горький вкус чая. Галлатированные катехины имеют горечь и терпкость сильнее, чем у простых чайных катехинов.

В нашем исследовании интенсивность вяжущего вкуса и концентрации общих катехинов и галлатированных катехинов не показали значимой корреляции. Однако интенсивность горького вкуса и концентрации общих катехинов (r = 0,79, р <0,05) и галлатированных катехинов (r = 0,63, р <0,05) имели значительные корреляции.

Теафлавины имеют вяжущий вкус и влияют на цвет чайного настоя. В нашем исследовании интенсивность вяжущего вкуса и концентрации теафлавинов не имели существенной корреляции. Флавоновые гликозиды являются важным источником вяжущего вкуса, а их гидролиз влияет на интенсивность вяжущего вкуса. Следовательно, изменение вяжущего и горького вкусов может быть связано с общим эффектом катехинов, теафлавинов и флавоноидных гликозидов.

Негаллированные катехины EGC и EC являются основными источниками сладкого послевкусия в настое зеленого чая, и интенсивность сладкого послевкусия увеличивается с концентрациями EGC и EC. В настоящем исследовании интенсивность сладкого послевкусия, а также концентрации EGC и EC увеличивались со временем полуферментации. Интенсивность сладкого послевкусия и концентрации EGC (r=0,83, p<0,05) и EC (r=0,62, p<0,05) инфузий были значительно коррелированы, что указывает на то, что негаллированные катехины EGC и EC вносили вклад в сладкое послевкусие.

Десять флавоноловых гликозидов были обнаружены в чаях, которые были полуферментированы в течение разных периодов времени. Исходными флавонолами были Vit, Que, Myr и Kae, которые были конъюгированы с моносахаридами галактозой (gala), глюкозой (glu), рамнозой (rha) и рутинозидом (rut). Обнаружено, что Myr-gala, Vit-rha, Que-gala и Kae-gala являются основными гликозидами флавонола.

При увеличенном времени полуферментации общие концентрации флавонолгликозидов и флавонолов несколько увеличились, что может быть связано с гидролизом флавонолдигликозидов, тригликозидов флавонола и тетрагликозидов флавонола. Моногликозиды флавонола могут также гидролизоваться до флавонов и моносахаридов. Между тем, концентрации Vit-rha, Kae-gala, Kae-rut, Vit, Que и Kae значительно увеличились, в то время как концентрации Myr-rha, Que-rut и Myr значительно снизились (Таблица 3).
Оригинал статьи, таблицы и ссылки на литературу: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5821678/

Однако мы не обнаружили с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) дигликозиды флавонола, тригликозиды флавонола и тетрагликозиды флавонола из-за отсутствия стандартов для этих веществ.

В настоящем исследовании было обнаружено, что общие концентрации флавонолгликозидов и флавонолов значительно положительно коррелируют с интенсивностью вяжущего вкуса (r=0,72, р <0,05). Однако только концентрации Vit-rha (r = 0,57, p <0,05), Que-gala (r = 0,62, p <0,05), Kae-gala (r= 0,56, p<0,05) и Vit (r= 0,57, р<0,05) значительно коррелирует с интенсивностью вяжущего вкуса, указывая на то, что гликозиды флавонола также способствуют вяжущим свойствам настоя чая Улун.

​​​​​​​

​​​​​​​Свободные аминокислоты

Мы определили 16 свободных аминокислот в чаях, полуферментированных в течение различных периодов времени. Общая концентрация аминокислот варьировала от 224,85 до 257,71 мг/л. Теанин был наиболее распространенной аминокислотой, составляя 63,9–69,7% от общего количества аминокислот. Следующей была глутаминовая кислота, составляющая 5,4–10,0% от общего количества аминокислот. По мере увеличения продолжительности полуферментации концентрации аланина, цистеина, гистидина, триптофана и лизина постепенно увеличивались (таблица 4).
Оригинал статьи, таблицы и ссылки на литературу: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5821678/

Напротив, концентрации теанина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты и аргинина снижались с увеличением времени полуферментации. Концентрации глутаминовой кислоты и теанина снижались во время полуферментации, вероятно, из-за превращения глутаминовой кислоты в γ-аминомасляную кислоту или их реакции с сахаром с образованием ароматических соединений.

Глицин и аланин обладают довольно сильной сладостью, а глутамат натрия обладает типичным вкусом умами.

Теанин является характерной аминокислотой в чайном настое и является ключевым соединением для его вкуса умами. Ранение листьев и ферментация во время обработки чая могут привести к деградации белка, что повышает уровень некоторых свободных аминокислот. Примечательно, что теанин, не полученный в результате гидролиза чайного белка, происходит из глутаминовой кислоты и этиламина. Было установлено, что теанин нейтрализует горечь и терпкость чая Улун, увеличивая его сладость.

Было обнаружено, что γ-аминомасляная кислота является еще одним важным ароматическим соединением чая Улун. Однако мы не наблюдали значимой корреляции между концентрацией общих свободных аминокислот и интенсивностью вкуса умами (r = - 0,25, р > 0,05) в чае Улун.

​​​​​​​Влияние времени полуферментации на фактор, превышающий пороговое значение вкусо-активных соединений при настаивании чая Tieguanyin oolong

Факторы превышения дозы (Dot) вкусо-активных соединений в чае анализировали в соответствии с методом, описанным Scharbert and Hofmann. Точечный фактор, который представляет собой отношение концентрации к порогу вкуса, использовали для оценки вкусового вклада отдельных вкусовых соединений.

Вкусовые соединения были классифицированы в соответствии с вкусовыми качествами на шесть групп, а именно:

1. соединения, придающие вяжущую (puckering) терпкость и грубое ощущение во рту,
2. соединения, придающие сухость во рту и похожие на бархатистость,
3. соединения с горьким вкусом,
4. соединения со сладким вкусом и
5. умами-подобные вкусовые соединения (Таблица 5).
   ​​​​​​​Оригинал статьи, таблицы и ссылки на литературу: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5821678/

Сухость во рту и бархатистая терпкость были вызваны в основном Que-rut, Vit-rha, Myr-gala, Que-gala and Que-glu, в то время как у черного чая Dajiling (в оригинале статьи написано именно так, а не « Darjeeling») в основном это были гликозиды флавонола, а именно пять флавонол-3-моногликозиды, два флавонол-3-3-дигликозида и один флавонол-3-тригликозид. Помимо типа флавон-3-ола агликона, тип и последовательность отдельных моносахаридов в гликозидной цепи были ключевыми факторами, влияющими на восприятие терпкости флавон-3-ола гликозидов.

Кофеин, EGCG и EC являются основными источниками горького вкуса чая Tieguanyin oolong, тогда как в черном чае Dajiling кофеин является единственным количественно преобладающим горьким вкусом.

Соединения с умами-подобным вкусом в основном включали аминокислоты. В соответствии с концентрациями и пороговыми значениями вкуса большинство вкусовых соединений, напоминающих умами, имеют точку <1, что означает, что эти соединения не вносят значительный вклад во вкус чая Tieguanyin oolong.

При увеличенном времени ферментации общий Dot-фактор соединений, придающих терпкость и вяжущее ощущение во рту, почти не изменился, но общий Dot-фактор соединений, придающих сухость во рту и похожий на бархатистость, уменьшился. Однако оба фактора Dot не были значительно коррелированы с интенсивностью вяжущего вкуса, вероятно, из-за взаимодействия между двумя группами соединений. При увеличенном времени ферментации общий Dot-фактор соединений с горьким вкусом уменьшался, аналогично интенсивности горечи.

Газовую хроматографию-масс-спектрометрию в сочетании с твердофазной микроэкстракцией в свободном пространстве проводили для анализа летучих соединений в образцах чая Улун, полуферментированных в течение различных периодов времени. Пятьдесят пять соединений были предварительно определены по их индексу удерживания и масс-спектрам (таблица 6).
Оригинал статьи, таблицы и ссылки на литературу: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5821678/

Летучие компоненты состояли из 15 альдегидов, 13 сложных эфиров, 8 спиртов, 6 кетонов, 5 ароматических углеводородов, 4 алкенов, 1 кислоты и 3 разных соединений. Количественно сложные эфиры (26,7–39,4%), спирты (16,0–26,7%) и альдегиды (13,4–18,8%) были доминирующими в летучих веществах чая. А (Z)-3-гексенилгексаноат (64,34–162,81 мкг/л), неролидол (63,85–109,03 мкг/л), индол (40,93–60,44 мкг/л), лимонен (26,10–75,92 мкг/л) и деканаль (14,00–45,23 мкг/л) были основными соединениями.

Чайный аромат зависел от смеси обильных летучих соединений и их взаимодействия. Примечательно, что пороги запаха были жизненно важны для общего аромата чая. Эти летучие ароматические соединения (VFC) были ранее идентифицированы в чае Улун, зеленом чае и черном чае. VFC были разделены на две группы, I и II группы, которые придают слабый аромат и сладкий цветочный аромат соответственно. Индекс вкуса (FI), рассчитанный по соотношениям группы II и группы I, увеличился с 0,59 (12 ч) до 0,84 (24 ч), а затем снизился до 0,63 (32 ч). Вариации FI соответствуют интенсивности цветочного аромата.

Увеличение времени полуферментации значительно увеличило концентрации бензальдегида, (Z)-β-озимена, бензолацетальдегида, фенилацетонитрила, гексилбутирата, (Z)-3-гексенилизовалерата, гераниола, фенетилацетата, индола, метилгераната, гексилгексаноата, кумарина, (E)-β-фарнезена, фенилэтилизовалерата, α-фарнезена, неролидола, фенетилбутирата и миристиновой кислоты, большинство из которых являются сложными эфирами. Между тем, концентрации октаналя, лимонена, линалоола, нонаналя и деканаля, которые были в основном из низких альдегидов, показали значительное снижение за тот же период. В отличие от времени ферментации, равного 12 часам, время ферментации, равное 32 часам, привело к увеличению количества фенилэтилизобутирата, фенетилбутирата и пальмитиновой кислоты на 1171,1%, 995,4% и 545,5% соответственно. Как упоминалось ранее, количество фенилацетальдегида, бензолацетонитрила, метилсалицилата, гераниола и индола увеличивается после полуферментации. Концентрации этих летучих соединений, как правило, увеличивались со временем полуферментации и вносили значительный вклад в цветочный аромат чая Улун, который образуется при гидролизе гликозидов во время обработки чая.



Заключение

Результаты этой работы позволяют предположить, что изменение вкуса связано с вкусо-активными и ароматически-активными соединениями в чае Улун.

• Национальным фондом естественных наук Китая (31101248, 31671861),
• Фондом естественных наук Чжэцзяна (LR17C160001),
• Инновационным проектом Китайской академии сельскохозяйственных наук (CAAS-ASTIP-2014-TRICAAS) и
• Young Elite Программой спонсорства ученых от CAST.

Информация о авторах:

Научно-исследовательский институт чая Китайской академии сельскохозяйственных наук, Ключевая лаборатория биологии чая и его использования, Министерство сельского хозяйства, 9 South Meiling Road, Ханчжоу, 310008 Китай